RT-PCR是指將逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Tranion；RT)反應(yīng)和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)組合在一起的方法。
1、RT-PCR的原理
RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以為RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。
2．2 RT-PCR的步驟
⑴在冰浴離心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；
⑵70度水浴5分鐘，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對(duì)）；
⑶加入5×反應(yīng)液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP 2uL（這些應(yīng)該先配好，然后分再裝到每一管），混勻；
⑷37度水浴5分鐘，加入1uL AMV-RT反轉(zhuǎn)錄酶，混勻；
⑸37度水浴1小時(shí)（此步是反轉(zhuǎn)錄過(guò)程）；
⑹70度10分鐘結(jié)束反應(yīng)（此處是滅活酶活性，避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾），產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步PCR實(shí)驗(yàn)，余下的-70度保存。