在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加酶結合物和顯色劑后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。

一、溫育的時間選擇

溫育這一步是ELISA測定中*容易出現問題的步驟。目前國內ELISA試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鐘-1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時才能有較完全的結合，低于1小時，可能會影響測定下限。

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有*貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應是需要一定時間的溫育。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。

二、溫育的溫度選擇

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。

在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中*，以形成*多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。